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IFA和IPMA方法測定豬瘟兔化弱毒病毒含量


來源:       發布時間:2014/9/1 0:00:00     點擊率:541

IFAIPMA方法測定豬瘟兔化弱毒病毒含量

李晶梅,謝紅玲

(武漢中博生物股份有限公司,武漢 430070

摘要:本研究使用間接免疫熒光方法(IFA)和過氧化物酶單層試驗(IPMA)測定豬瘟兔化弱毒的病毒含量(TCID50)。兩種方法都使用韓國JBT公司豬瘟單抗作為一抗,此單抗的稀釋倍數最高為300倍。Trueblue過氧化物酶底物顯色的、感染豬瘟兔化弱毒的陽性細胞呈現藍色易于辨識,所以確定TrueblueIPMA方法中的酶作用底物。建立的的IFAIPMA方法與兔體反應熱法進行了比較,證明兩者存在一定平行關系,但IFAIPMA比兔體反應熱法檢測結果的數值低1個數量級左右?;諞隕轄峁?,TCID50方法可作為豬瘟疫苗效力檢驗的候選方法。

關鍵詞:豬瘟兔化弱毒;TCID50;IPMA;IFA

豬瘟病毒(CSFVC株,又名豬瘟兔化弱毒株(HCLV),由其制備的豬瘟兔化弱毒活疫苗是廣泛使用的主流豬瘟疫苗。兔體感染量(RID)和豬體半數?;ち浚?SPAN lang=EN-US>PD50)是評價疫苗效力的指標。動物的飼養狀況、健康狀況等個體差異也會對檢驗結果產生影響。TCID50是病毒含量的測定方法之一,病毒在細胞內繁殖引起細胞病變(CPE),通過CPE的判定,計算病毒含量。CSFV不引起CPE,所以CSFV 病毒含量測定要結合免疫熒光方法(FA)、間接免疫熒光方法(IFA)或過氧化物酶單層試驗(IPMA)等免疫學方法進行判定。

結合IFAIPMACSFV  TCID50的效價測定方法見于很多報道[1-3]。由于各文獻并未對方法中的操作進行標準化,所以在實際應用中各反應條件均需逐一優化。本研究參考前人方法、結合自身經驗、優化反應條件,建立了結合IFAIPMAHCLV  TCID50的效價測定方法。方法使用的細胞為易于培養的ST傳代細胞;豬瘟抗體選擇的是可以商品化購得的豬瘟單抗;篩選的過氧化物酶底物TrueBlue的顯色效果優于DAB、AEC。現將方法和條件優化過程整理如下。

1  材料和方法

1.1  材料

1.1.1  細胞和毒種    ST細胞、豬瘟兔化弱毒株、豬瘟半成品疫苗和豬瘟成品疫苗(細胞源,犢牛睪丸細胞)由本公司保存。

1.1.2  主要試劑    豬瘟單抗為韓國JBT公司產品,MEM培養基為Gibco公司產品,新生牛血清(NBS)為金源康公司產品,羊抗鼠IgG-FITCThermo公司產品,HRP-SPASigma公司產品,TrueBlue 過氧化物酶底物為KPL公司產品,AECDAB過氧化物酶底物為武漢博士德公司產品,細胞培養液為含8% NBSMEM,病毒培養液為含2%NBSMEM。

1.1.3  實驗動物    大耳白兔,購自武漢生物制品研究所。

1. 2 方法

1.2.1 豬瘟病毒感染ST細胞    -70保存的HCLV濕毒室溫水浴使其解凍,備用。取密度為1.0×1053.0×105個細胞/mlST細胞懸液,接種到96孔細胞培養板,每孔100μl ,37,5%CO2貼壁培養16h24h,待細胞長滿單層,棄去細胞培養液,加入病毒培養液100μl,接種病毒培養液適當稀釋的HCLV 100μl,繼續培養72h96h,備用。

1.2.2 建立IFA檢測方法

1.2.2.1操作步驟    棄掉1.2.196孔板內的病毒培養液,PBS洗細胞2次,80%冷丙酮固定細胞培養板10min20min,PBS洗細胞2次,加入一抗(豬瘟單抗),37℃孵育1h,PBS洗細胞4次,加入二抗(羊抗鼠IgG-FITC),37℃孵育1h,PBS洗細胞4次,雙蒸水洗細胞1次,倒置熒光顯微鏡觀察。

1.2.2.2抗體稀釋度優化    100倍、300倍、1000倍稀釋的一抗用于IFA操作,按照1.2.2.1方法從上述三個稀釋倍數中選出一抗的最適稀釋度。二抗為常用商品化試劑無需優化使用濃度,即羊抗鼠IgG-FITC按說明書建議的100倍稀釋使用。

1.2.3建立IPMA檢測方法

1.2.3.1操作步驟    棄掉1.2.196孔板內的病毒培養液,PBS洗細胞2次,80%冷丙酮固定細胞培養板10min20min,PBS洗細胞2次,加入一抗(豬瘟單抗),37℃孵育1h,PBS洗細胞4次,加入二抗(HRP-SPA),37℃孵育1h,PBS洗細胞4次,雙蒸水洗細胞1次,加過氧化物酶底物,37℃孵育10min60min,棄去底物,雙蒸水洗細胞1次,倒置顯微鏡觀察。

1.2.3.2抗體稀釋度優化    100倍、300倍、1000倍稀釋的一抗用于IPMA操作,按照1.2.3.1方法從上述三個稀釋倍數中選出一抗的最適稀釋度。二抗為常用商品化試劑無需優化使用濃度,即HRP-SPA按說明書建議的8000倍稀釋使用。

1.2.3.3 底物選擇    按照1.2.3.1方法對使用的過氧化物酶底物種類進行優化,從AEC、DABTrueBlue中選擇辨識度最高的顯色底物。

1.2.4 IFA方法或IPMA方法測定細胞源豬瘟疫苗半成品和成品的病毒含量   -20保存的疫苗半成品室溫水浴使其解凍;成品苗測定前以疫苗稀釋液復溶至凍干前體積。使用96孔細胞培養板,選擇10-110-6六個稀釋度,每稀釋度重復6孔,每孔加100μl,并設不接毒對照6孔。按1.2.1、1.2.2、1.2.3方法接毒和檢測。觀察到陽性信號的孔記為陽性,否則為陰性。Reech-Muench法計算并換算出樣品的病毒含量(TCID50/ ml)  。

1.2.5 細胞源豬瘟疫苗半成品和成品的RID測定    1.2.6中的半成品和成品疫苗以《中華人民共和國獸藥典》上的方法測定RID[4],并與TCID50測定結果比較。每個樣品測定20萬倍、50萬倍、100萬倍、200萬倍四個稀釋度。

2  結果

2.1 IFA方法優化條件

倒置熒光顯微鏡下觀察,100倍、300倍、1000倍稀釋的一抗用于檢測,陰性細胞無任何背景(圖1A)。陽性細胞以100倍、300倍稀釋的一抗檢測,熒光信號明顯(圖1B);以1000倍稀釋的一抗檢測,熒光信號較弱(圖1C),因此,一抗稀釋倍數最高確定為300。96孔病毒培養板以80%丙酮固定,經過一抗、二抗各1小時的孵育,可見光下觀察,孔內細胞脫落少(圖1D),可以很好的避免漏檢。

 

B

 

D

 

C

 

A

 

     

 

A陰性孔100倍稀釋一抗;B陽性孔300倍稀釋一抗;C陽性孔1000倍稀釋一抗,D 可見光下細胞狀態

1 HCLV免疫熒光

2.2 IPMA方法優化條件

從圖可以看出, 100倍稀釋一抗后AEC、DAB、TrueBlue都有很好的顯色效果(圖2A、B、C),一抗二抗相同的情況下,Trueblue顯示藍色,與粉色AEC和棕色DAB比較更易辨識;1000倍稀釋一抗后AEC、DAB顯色孔中幾乎無法辨識出陽性信號,TrueBlue顯色孔仍可辨識(圖2G、H、I);而300倍稀釋一抗后TrueBlue顯色,結果辨識度好,又不需要高濃度單抗(圖2F )。綜合以上結果,最終選用使用300倍稀釋一抗,TrueBlue顯色。96孔病毒培養板以80%丙酮固定,經過一抗、二抗各1小時的孵育,顯色液10min60min孵育,孔內細胞脫落少(圖2),可以很好的避免漏檢。

 

   

A 一抗100倍稀釋AEC顯色;B 一抗100倍稀釋DAB顯色;C一抗100倍稀釋TrueBlue顯色;

D 一抗300倍稀釋AEC顯色;E 一抗300倍稀釋DAB顯色;F一抗300倍稀釋 TrueBlue顯色;

G一抗1000倍稀釋AEC顯色;H 一抗1000倍稀釋DAB顯色;I一抗1000倍稀釋TrueBlue顯色

2 IPMA不同一抗稀釋倍數,不同底物顯色結果

2.3 IFA方法和IPMA方法測定HCLV病毒含量

用確定的IFA方法測定

HCLV病毒含量。本次操作,可觀察到陽性信號的最高稀釋度孔為10-4稀釋度,陽性信號強烈(圖3A)。少量甚至單個細胞胞漿顯示的熒光信號也清晰可見(圖3A箭頭所指)。

用確定的IPMA方法測定HCLV病毒含量。本次操作,可觀察到陽性信號的最高稀釋度孔為10-4稀釋度,陽性信號強烈,少量甚至單個細胞胞漿藍色著染也清晰可見(圖3B箭頭所指)。

 

B

 

A

 

 

A IFA;B IPMA

3 IFA、IPMA可檢測到陽性信號的最高病毒稀釋度

 

2.4 IFA、IPMA法與兔熱法測定豬瘟兔化弱毒病毒含量比較

以疫苗稀釋液復溶的豬瘟成品疫苗,存在凍干?;ぜ?,操作IFA、IPMA前觀察,10-1稀釋度孔細胞狀態略差于對照孔細胞,IFAIPMA操作后,細胞脫落20%80%。操作IFA、IPMA前后,10-2稀釋度孔細胞狀態與對照孔細胞無差異。

同一樣品IFA方法、IPMA方法各三次重復測定,結果無顯著差異。說明IFA方法、IPMA方法測定結果重復性較好。測定的病毒含量TCID50數值與兔體反應熱方法測定的RID數值,差異較大,但有一定的平行關系。RID結果數值高于TCID50結果數值1個滴度左右。詳細結果見表1。

1 IFA方法、IPMA方法及兔體反應熱方法測定病毒含量比較

被檢樣品

IFA(TCID50/ml)

IPMA(TCID50/ml)

RID(RID/ml )

半成品1

105.3±0.26105.0105.5*

105.25±0.25105.0105.5*

2×106

半成品2

105.4±0.14105.25105.5*

105.33±0.14105.25105.5*

2×106

成品1

104.4±0.13104.25104.5*

104.3±0.26104.0104.5*

0.5×106

成品2

/

104.5

1×106

成品3

/

104.33

0.5×106

成品4

/

104.0

0.2×106

成品5

/

103.67

0.5×106

*為三次重復測定,平均數±標準差,括號中的數值為數據范圍

3 討論

前人將IFA、IPMA兩種免疫學方法分別應用到CSFV檢測中,解決了CSFVCPE、無法直接判定細胞是否感染的難題。以此為基礎,還開發了結合IFAIPMA的豬瘟病毒TCID50測定方法,方法的具體操作步驟和應用見于很多報道[1-3,5]。筆者使用商品化豬瘟單抗、優化的檢測條件,對豬瘟疫苗病毒含量進行測定,以期作為RIDPD50的補充方法加強豬瘟疫苗的質控。現就HCLV IFAIPMA方法的優化和應用做如下分析。

本研究篩選的IPMA底物顯示藍色有很好的辨識度,同一樣品IPMA方法和IFA方法測定的TCID50結果也相近,加之IPMA操作無需昂貴的熒光顯微鏡,所以IPMA測定方法非常適合應用到HCLV定量中。

 將優化的IFA、IPMA方法用于測定某批次(細胞源)豬瘟疫苗成品、半成品的疫苗效價。豬瘟疫苗半成品為含有豬瘟病毒的細胞培養液,在檢測前無需特殊處理。豬瘟成品疫苗是半成品中加入凍干?;ぜ煉掣珊蟮鬧破?,測定前以疫苗稀釋液復溶至凍干前體積。10-1稀釋的豬瘟成品疫苗由于?;ぜ僚ǘ雀?,使得細胞狀態略差于對照孔細胞。10-2稀釋的豬瘟成品疫苗,雖然存在少量凍干?;ぜ?,但不對細胞狀態造成影響。

《中華人民共和國獸藥典》將RIDPD50作為評定豬瘟疫苗效力的方法[4]。實際操作中受實驗動物質量的影響,有時檢測結果不能夠完全反應疫苗效價。而IFA、IPMA方法簡單,受外界因素影響小,結果穩定。方法可以應用到豬瘟疫苗半成品和成品檢驗中作為RIDPD50的輔助方法控制疫苗質量。從本研究的少量數據分析,IFA、IPMA方法與兔熱法測定的病毒含量存在差異,兔熱法測定數值更高。但是不同方法測定結果(RID、PD50TCID50)的對應關系在文獻中有不同于本研究的結果,各研究結果也存在差異 [1-3,6],可能是RID、PD50測定時實驗動物個體差異、IFA、IPMA測定時細胞狀態不同或檢測用抗體敏感度不同引起。現有文獻中不同方法測定結果之間的平行關系數據相對較少,還不足以得出準確結論,有必要深入系統研究,以期選出一種簡單準確的方法用于豬瘟疫苗效價。