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豬圓環病毒2型cap蛋白ELISA檢測方法的建立及初步應用


來源:       發布時間:2014/9/1 0:00:00     點擊率:47

豬圓環病毒2cap蛋白ELISA檢測方法的建立及初步應用

廖園園,謝紅玲

(武漢中博生物股份有限公司,武漢 430070

摘要:將桿狀病毒表達系統表達并經梯度離心純化的PCV2 Cap蛋白作為標準品,利用雙抗夾心法建立了針對豬圓環病毒2型抗原的檢測方法,并應用于圓環病毒2型基因工程疫苗的質控。結果表明,多抗最適包被濃度為1µg/ml,最佳封閉液為1%BSA,最佳單抗反應濃度為2µg/ml,反應時間60min,最佳二抗使用稀釋度為1:40000,反應時間為60min,最佳抗原反應時間為60min。該方法與Sf9細胞、BSA和其它豬病病毒抗原之間無交叉反應,最低檢測抗原量為5ng。

關鍵詞:豬圓環病毒2型,衣殼蛋白Cap,ELISA,抗原檢測,夾心法

豬圓環病毒2(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引發斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原,該病主要以患畜生長緩慢、進行性消瘦和多系統病理損傷為特征。除了引發PMWS外,PCV2還與豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)、豬增生性壞死性肺炎(PNP)、仔豬先天性震顫(CT)、母豬繁殖障礙等疾病相關。Cap蛋白是該病毒的主要結構蛋白,含有4個抗原表位,具有較好的免疫原性和抗原性,是檢測該病毒特異性抗體的理想靶抗原表位,也是現在基因工程疫苗研究的熱點蛋白。為建立一種敏感、特異、快速的豬圓環病毒2型抗原檢測方法,使PCV2基因工程苗的質控更快更準更方便,本研究利用雙抗體夾心法建立了一種檢測PCV2 Cap蛋白的方法,并初步應用于豬圓環病毒2型亞單位基因工程疫苗的質量檢測。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑和儀器  PRV細胞毒樣品,PPV樣品,PRRSV樣品,CSFV樣品和PCV1樣品由本實驗室保存;HRP標記的羊抗小鼠IgG二抗、HRP標記的羊抗兔IgG二抗及TMB購自Sigma公司;牛血清白蛋白(BSA)購自Ameresco公司;BCA蛋白定量試劑盒購自GE公司;酶標板購自深圳金燦華公司;其他化學試劑主要來自國藥集團化學試劑公司分析純。其他主要設備有:包被機,洗板機,酶標儀,恒溫孵育箱。

1.1.2 PCV2 Cap蛋白的制備  提取豬圓環病毒2型(PCV2)基因組,通過設計特異性引物擴增ORF2基因片段,利用Bac-to-Bac系統構建能表達PCV2-ORF2基因(Cap蛋白)的重組桿狀病毒,將該重組桿狀病毒感染Sf9細胞,收獲表達的Cap蛋白,通過CsCl密度梯度離心純化后作為檢測的抗原標準品。

1.1.3 PCV2多抗和單抗的制備

PCV2 Cap蛋白常規免疫健康家兔,待兔血清中PCV2抗體用ELISA方法(生產公司和產品索取號應在試劑中列出)[LYY1] 檢測效價達1:1 000以上,即可采血分離血清。分離的血清通過辛酸-硫酸銨沉淀法進行純化獲得所需抗PCV2抗原純化多抗。

應用雜交瘤技術制備單抗,PCV2 Cap蛋白常規免疫BALB/c小鼠,得到抗原刺激的脾臟細胞,將脾臟細胞和小鼠的骨髓瘤細胞系進行融合,利用HAT選擇性培養基篩選雜交瘤細胞,用ELISA方法和IFA(間接免疫熒光)方法鑒定抗PCV2的雜交瘤細胞株,進行三次亞克隆化后得到分泌高特異性的單克隆抗體的細胞株,通過小鼠腹水生產抗PCV2的單克隆抗體,通過辛酸-硫酸銨沉淀法將腹水進行純化,獲得的既為所需抗PCV2單克隆抗體。

1.2 ELISA方法的建立

1.2.1 最佳抗體包被濃度、單抗使用濃度和二抗使用濃度的確立

按照方陣滴定方法優化ELISA反應條件。以pH9.6碳酸鹽緩沖液將純化的抗PCV2-Cap多抗稀釋至終濃度為0.5,1,2,4µg/ml,100µl/孔包板,4過夜。PBST洗板后,加1%BSA封閉2h??乖曜計酚?SPAN lang=EN-US>PBS稀釋,濃度為3.2,1.6,0.8,0.4,0.2,0.1,0.05,0µg/ml,100µl/孔,同時設陰性對照,37,1h。PBST洗板后,分別加入終濃度為1,2,4µg/ml的抗PCV2-Cap單抗,100µl/孔,37,1h。PBST洗板后,分別加入1:20000、1:400001:80000稀釋的二抗,100µl/孔,37,1h。PBST洗板后加入TMB底物溶液,100 µl/孔,37 10min。加入1mol/LH2SO4 5Oµl/孔,終止反應,于酶標儀450 nm讀數,每個稀釋度重復一次,取其平均值。應用軟件CurveExper進行結果分析。

1.2.2 封閉液的確定

以最佳多抗濃度包被酶標板,洗滌,分別用含0.5BSA、1BSA、1.5BSA、2BSA、5%脫脂乳、2%明膠及1 BSA+0.5%酪蛋白PBST 200µl/孔,37 封閉2 h,抗原標準品按1.2.1方法稀釋,進行ELISA測定,其他步驟同1.2.1。比較各組陰、陽性樣品的OD值和PN值,以選擇合適的封閉液。

1.2.3 封閉時間的選擇

以最佳多抗濃度包被酶標板,洗滌,用確定的封閉液200µl/孔,分成3組,分別為37 封閉1h,372 h,373 h ,424 h。封閉后,抗原標準品按1.2.1方法稀釋,進行ELISA測定,其他步驟同1.2.1。比較各組陰、陽性樣品的OD值和PN值,以選擇合適的封閉時間。

1.2.4 單抗反應時間的確定

    酶標板按照確定的條件包被和封閉后,抗原標準品按1.2.1方法稀釋,進行ELISA測定,單抗反應時間分別為30min,45min,60min,75min,其他步驟同1.2.1。比較各組陰、陽性樣品的OD值和PN值,以選擇最佳單抗反應時間。

1.2.5 酶標二抗反應時間的確定

    酶標板按照確定的條件包被和封閉后,抗原標準品按1.2.1方法稀釋,進行ELISA測定,酶標二抗反應時間分別為30min,45min,60min,75min,其他步驟同1.2.4。比較各組陰、陽性樣品的OD值和PN,以選擇最佳酶標二抗反應時間。

1.2.6 特異性試驗

分別取Sf9陰性細胞裂解樣品,BSA,PRV細胞毒樣品,PPV樣品,PRRSV樣品,CSFV樣品,PCV1樣品,PCV2基因工程苗樣品,1:101:100稀釋后進行ELISA測定。同時設立標準品和陰性對照。

1.2.7 重復性試驗

    3個不同批次的試劑盒分別檢測PCV2基因工程苗樣品和陰性細胞樣品,每份樣品重復檢測4次,計算批內及批間變異系數(C.V)。

1.2.8 比較試驗

    分別應用本方法和蛋白電泳及bandscan軟件進行蛋白含量分析兩種方法對PCV2基因工程疫苗進行檢測,比較結果。

2 結果

2.1 最佳抗體包被濃度、單抗使用濃度和二抗使用濃度的確立

方陣試驗如表1所示,相關系數(γ)值越高標準誤(S)值越低的組別,包被條件和單抗及二抗濃度的條件越佳。確定多抗最佳包被濃度為1µg/ml,單抗最佳濃度為2µg/ml,二抗最佳稀釋度為1:40000。

1    PCV2-Cap ELISA方陣滴定實驗結果分析

 

 

多抗濃度(µg/ml)

二抗稀釋度

單抗濃度(µg/ml)

0.5

1

2

4

γ

S

γ

S

γ

S

γ

S

1:20000

1

0.9456

0.321

0.99866

0.2409

0.99634

0.245

0.9778

0.215

2

0.9870

0.196

0.99974

0.1255

0.99789

0.067

0.9985

0.135

4

0.9942

0.124

0.99820

0.0721

0.99945

0.134

0.9934

0.179

1:40000

1

0.9870

0.220

0.99963

0.4401

0.99800

0.340

0.9871

0.231

2

0.9982

0.096

0.99994

0.0175

0.99959

0.046

0.9992

0.035

4

0.9963

0.120

0.99910

0.0530

0.99960

0.120

0.9981

0.182

1:80000

1

0.9934

0.078

0.99912

0.0661

0.99923

0.129

0.9934

0.238

2

0.9978

0.124

0.99271

0.1021

0.99566

0.209

0.9988

0.103

4

0.9770

0.178

0.99882

0.0987

0.99547

0.088

0.9919

0.245

2.2 封閉液的確定

結果見表2,1%BSAPN值最高,封閉效果最好。

2    封閉液的確定

封閉液

陽性樣品P/N

陰性對照OD

1

2

3

4

5

6

0.5BSA

5.38

7.06

8.09

9.13

9.78

10.21

0.102

1BSA

7.30

9.46

11.91

13.14

14.48

15.46

0.063

1.5BSA

7.25

9.14

11.01

12.78

13.66

15.02

0.059

2BSA

7.16

9.07

11.26

12.37

13.10

14.76

0.062

1BSA +0.5%酪蛋白

7.1

8.91

11.2

12.89

13.21

14.55

0.061

2%明膠

5.12

6.92

7.9

8.67

9.15

10.09

0.087

5%脫脂乳

6.99

8.79

10.88

12.98

13.09

13.93

0.073

2.3 最佳封閉時間的確定

結果見表3,用1%BSA封閉2h的效果最好。

3    封閉時間的確定

封閉時間

陽性樣品P/N

陰性對照OD

1

2

3

4

5

6

37,1h

5.09

6.21

8.09

9.22

10.98

11.14

0.078

37,2h

7.41

9.42

11.86

13.12

14.44

15.32

0.056

37,3h

7.30

9.12

11.50

12.99

13.12

14.71

0.062

4,24h

6.23

8.44

10.12

12.23

13.02

13.87

0.061

2.4 最佳單抗反應時間的確定

結果見表4,當反應時間為60min的時候,效果最佳,P/N值最高。

4    單抗反應時間的確定

單抗反應時間

陽性樣品P/N

陰性對照OD

1

2

3

4

5

6

30min

6.11

6.96

7.82

8.89

10.23

11.34

0.058

45min

6.88

7.95

9.56

11.56

12.89

13.09

0.061

60min

7.33

9.24

11.56

13.09

14.82

15.54

0.055

75min

4.06

5.13

6.34

7.27

9.23

10.02

0.102

2.5 最佳二抗反應時間的確定

結果見表5,當二抗反應時間為60min的時候,效果最好。

5  二抗反應時間的確定

二抗反應時間

陽性樣品P/N

陰性對照OD

1

2

3

4

5

6

30min

6.23

6.78

7.92

8.99

10.76

11.78

0.052

45min

6.77

7.99

9.88

11.62

12.56

13.89

0.065

60min

7.39

9.44

11.28

13.43

14.77

15.87

0.067

75min

4.34

5.89

6.78

7.69

9.45

9.89

0.134

2.6特異性試驗

    用該方法分別檢測Sf9陰性細胞裂解樣品,BSA,PRV細胞毒樣品,PPV樣品,PRRSV樣品,CSFV樣品和PCV1樣品,結果均為陰性;檢測PCV基因工程苗樣品為陽性,最低檢測量可達5ng。標明該方法具有很好的特異性和靈敏度。

2.7 重復性試驗    該方法制備的3批試劑盒檢測PCV2基因工程苗樣品和陰性細胞樣品(特異性實驗中沒有陰性細胞樣品的檢測)[LYY2] 的結果為,批內變異系數2%~4%,批間變異系數3%~6%,均小于10%,表明該方法有較好的重復性。

2.8 比較試驗

    通過對三批PCV2基因工程疫苗樣品檢測發現:雙抗體夾心法檢測結果分別為60µg/ml、87µg/ml102µg/ml。對應蛋白電泳及bandscan軟件分析的Cap蛋白含量分別為66µg/ml 、92µg/ml110µg/ml,實驗結果表明這兩種方法檢測結果差異不大。

3 討論

目前,國內外采用的PCV2檢測技術主要有:病毒分離培養,間接免疫熒光,免疫酶單層實驗(IMPA),原位雜交(ISH),聚合酶鏈式反應(PCR)等等。其中PCR熒光定量檢測方法靈敏度高,是現在實驗室檢測PCV2病毒的首選方法。但是此方法使用的儀器昂貴,對操作人員要求較高,不適合推廣普及到基層單位和豬場。本研究利用雙抗體夾心發建立了一種檢測PCV2 Cap蛋白的方法,并初步應用于豬圓環病毒2型亞單位基因工程疫苗的質量檢測,使用效果好。

本方法建立的關鍵是標準品的制備,PCV基因組由一條共價閉合環狀單股DNA構成,包含兩個大的開放閱讀框架ORF1ORF2,分別編碼病毒蛋白復制酶(Rep)和病毒衣殼蛋白(Cap)。Cap蛋白是病毒的主要結構蛋白,是檢測該病毒特異性抗體的理想靶抗原。由于該病毒在體外培養不產生細胞病變,病毒繁殖能力低,難于獲得高產量的病毒抗原用于診斷目的。本方法中的Cap蛋白來源于昆蟲桿狀病毒表達系統,本系統表達外源蛋白產量高、免疫活性好、產物易純化、反應背景低,在多種動物疫病診斷中得到應用。另外,我們還建立了檢測PCV2衣殼蛋白抗體水平的方法,用以反映PCV2的抗體水平,對豬群PCV2抗體水平進行監測,以確切了解豬體免疫水平或感染狀況,這兩種方法的建立,為有效預防和控制PCV2的侵襲和傳播,避免因該病發生而引起的重大經濟損失。

本研究初步建立了一種PCV2-Cap抗原檢測方法,后續工作還需要完成試劑盒的組裝以及試劑盒敏感性、特異性和穩定性的研究并加強試劑盒的優化。


 [LYY1]用的間接ELISA法檢測,二抗試劑在1.1.1中已經補充。

 [LYY2]就是2.6中的sf9細胞。